插入片段测通

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插入片段测通

产品介绍

插入片段测通

插入片段全长精准测序解决方案。基于纳米孔单分子长读长技术，无需 PCR 扩增与分段引物设计，单次测序即可完整获取插入片段全长序列，高效解析高 GC、重复序列、同源序列等复杂结构，为客户给予从样本处理、测序实验到高质量一致性序列、可视化质控报告的全流程一站式服务，保障插入片段验证的准确性、完整性与高效性。

应用方向

重组质粒插入片段完整性验证
基因克隆插入区序列精准校对
合成基因 / 优化基因全长质控
载体多片段插入结构确认
基因编辑插入位点与序列检测

诺禾优势

极速交付：依托长读长测序原理，最快可在12小时内完成从样本到分析报告的全程交付。
无惧复杂：超长读长直接跨越质粒中高GC、重复序列等复杂区域，实现一次性完整测通。
无需引物：无需PCR扩增，简化实验流程，显著节省时间与引物成本。
交付全面：除一致性序列外，同步给予覆盖度图、突变列表及原始数据等全方位结果，分析更直观。
性价比高：单次反应即可取得全长序列，显著节省时间与成本。

信息分析

送样建议

1）菌液样本：
新鲜菌液≥1ml，或给予沉淀菌体（用于质粒提取）；
2）质粒样本：
浓度：Qubit 定量≥10ng/μl，20μl，电泳可见明显条带。
纯度：OD260/280=1.8-2.0，OD260/230=2.0-2.2，不含去污剂、盐、蛋白等杂质；
用量：体积≥10μl，总量≥200ng（50kb 以上大质粒需≥600ng）；
溶解液：用超纯水（双蒸水 / Milli-Q），勿用 TE 缓冲液（影响测序效果）。
3）样本打包和寄送建议
核酸样品建议使用1.5ml或2ml 低吸附EP管装载样品，并用封口膜封口，冰袋运输

常见问题

1.全质粒测序和传统的 Sanger 测序有什么区别？
- 核心区别在测序范围、复杂区域覆盖能力和结果完整性。传统 Sanger 测序是 “片段测序”，仅能测 1kb 以内的目的基因或特定区域，无法覆盖高 GC、重复序列等复杂区域，且需拼接推测整体结构；全质粒测序（尤其基于纳米孔平台）能测通质粒全长，直接覆盖目的基因、载体骨架等所有区域，无需拼接，还能精准检出低丰度突变，更适合完整验证和质控。
2.纳米孔测序与Sanger测序相比有哪些优势？
- 不收取亚克隆费用，客户首次寄送载体只需增加3个工作日进行验证，客户寄送载体样品尽量给予1ug以上。
3.如何判断测序结果是否可靠？
- 查看覆盖度图：深度应均匀，无明显缺口或尖峰。
  查看突变列表：高频突变（>30%）在非Poly区域通常可信。
  查看片段长度分布图：应有明确主峰，且与预期长度一致。
  查看 .ab1 色谱图：峰形应陆续在、清晰，无明显杂峰。
4.什么是“多聚体（concatemer）”？是否影响结果？
- 多聚体是质粒在体内复制过程中形成的连环体（如二聚体、三聚体）。
  本流程默认返回单体序列，多聚体比例在 _multimer_analysis.txt 中显示。
  多聚体不影响序列准确性，且可顺利获得未切割琼脂糖凝胶电泳验证。
5.如果样本为混合质粒（多个物种），会得到什么结果？
- 分析流程将优先为数据量最大的物种生成一致性序列。
  若混合物种间序列高度相似，则 .ab1 中可能出现混合峰，.var.xls 中列出突变。
  若物种差异显著，建议分别克隆后送检，或联系客服定制分析方案。
6.测序失败是否收费？能否重测？
- 完全测序失败（无数据产出）：不收费，可免费重测一次（限同一样本）。
  测序完成但分析异常：收取测序费，可免费重分析一次。
  风险样本测序失败：按实际数据产出情况判断是否收费。
7.单倍型分析适用于哪些样本？如何解读结果？
- 适用样本：杂合二倍体样本（如某些基因型验证、群体遗传分析）。
  结果文件： .haplotype1.fasta / .haplotype2.fasta：两个单倍型序列。
  ○.AF.violin.png：突变频率分布图，可判断杂合程度。
  ○.consensus.fasta：仅供参考，实际分析应以单倍型文件为准。
8.如何判定组装得到的质粒序列是完整的环状结构？
- 目标质粒本身是闭合环状 DNA，但在 Nanopore 测序建库与测序过程中，DNA 会被随机打断为线性长片段进行测序。我们使用的 Flye 组装软件针对长读长进行了优化，具备识别重复序列与环状结构的能力。在组装过程中，软件将所有测序得到的线性片段进行拼接。如果该质粒真实为环状，拼接所得的序列（contig）头部与尾部会存在显著的同源重叠区域。Flye 软件识别到这种首尾重叠后，会自动将序列两端进行“粘合”与调整，最终输出完整的环状质粒序列。因此，若最终组装结果呈现为单一环状 contig，即表明组装成功。
9.什么情况算“测序失败”？主要原因有哪些？
- 对于质粒测序，“失败”意味着您的样本没能产生足够数量和质量的数据，无法组装出靠谱的一致性序列。我们价格实惠、周期短，所以不包含对失败原因进行深度排查的服务。但根据经验，失败最常见的原因就两个：
  1.样本DNA浓度不够：
  这通常是因为用了Nanodrop来定量DNA。Nanodrop容易受杂质干扰导致数值虚高，强烈建议使用Qubit或同级别的荧光染料法进行定量。
  怎么发现？可以看看原始读长长度分布图，如果总数据量很少；或者看看覆盖度，如果很低，可能就是这个问题。
  2.样本太杂：
  比如混有多种质粒，或者污染了大量的基因组DNA片段，或者质粒本身已经断裂了。
  怎么发现？看看原始读长长度分布图，如果读长长度分布范围非常宽，不成峰，可能就是样本太杂。
  为了确保最好的测序效果，请一定按照我们推荐的样本送样建议来操作。
10.如何制备菌落样本？具体操作步骤是怎样的？
- 把挑好的菌落重悬后，一分为二，一部分自己留着备份培养，另一部分寄给我们测序。具体操作步骤如下：
  1.挑取单菌落：用无菌枪头（比如20 µL或10 µL的枪头）从培养板上挑取一个单菌落。
  2.重悬：直接将带菌的枪头放入您寄送给我们的样品管中，管内预先加入适量无菌水或TE缓冲液（一般20–50 µL），反复吹打或旋转枪头，使菌落充分重悬。注意：不要加入甘油或培养基，以免影响后续检测。
  3.备份菌种（关键步骤）：重悬后，用同一个枪头（不要换新枪头，因为枪头上还沾有少量菌液）立即进行备份操作。